CRISPR-Cas9在过去十年中一直在编辑人类基因组。尽管编辑的类型各不相同，但一个未解决的挑战是在没有双链DNA断裂的情况下整合大块DNA。现在，麻省理工学院的一个团队描述了一种名为PASTE(通过位点特异性靶向元件进行可编程添加)的新工具，该工具可将长达36,000个DNA碱基对的基因输送到几种类型的人类细胞(以及小鼠的肝细胞)中。PASTE使用与两种酶(一种逆转录酶和一种丝氨酸整合酶)融合的CRISPR–Cas9切口酶，用于靶向基因组募集和DNA整合。
该研究发表在NatureBiotechnology上，论文“使用CRISPR定向整合酶拖放基因组插入大序列而不进行双链DNA切割”。”
麻省理工学院麦戈文脑研究所的麦戈文研究员OmarAbudayyeh博士说：“这是一种新的遗传方法，有可能针对这些真正难以治疗的疾病。”“我们希望朝着基因疗法最初应该做的方向努力，即取代基因，而不仅仅是纠正个体突变。”
在这项研究中，研究人员专注于丝氨酸整合酶，它可以插入大块DNA，大至50,000个碱基对。这些酶靶向称为附着位点的特定基因组序列。当他们在宿主基因组中找到该位点时，他们会与其结合并整合他们的DNA有效载荷。
“就像CRISPR一样，这些整合酶来自细菌和感染它们的病毒之间正在进行的战斗，”麦戈文研究员JonathanGootenberg博士说。“它说明了我们如何能够不断从这些自然系统中找到大量有趣且有用的新工具。”
在过去的工作中，科学家们发现开发这些用于人类治疗的酶具有挑战性，因为附着位点非常特殊，并且很难重新编程整合酶以靶向其他位点。麻省理工学院的团队意识到，将这些酶与插入正确位点的CRISPR-Cas9系统相结合，可以轻松地对强大的插入系统进行重新编程。
PASTE包括一种Cas9酶，它在特定的基因组位点进行切割，由与该位点结合的RNA链引导。这使他们能够针对基因组中的任何位点插入附着位点，该位点包含46个DNA碱基对。这种插入可以在不引入任何双链断裂的情况下完成，方法是首先通过融合逆转录酶添加一条DNA链，然后添加其互补链。
一旦该位点被整合，整合酶就会出现并将其更大的DNA有效负载插入该位点的基因组中。
“我们认为这是朝着实现可编程插入DNA的梦想迈出的一大步，”Gootenberg说。“这是一种可以很容易地针对我们想要整合的站点和货物进行定制的技术。”
在这项研究中，研究人员表明他们可以使用PASTE将基因插入多种类型的人类细胞，包括肝细胞、T细胞和淋巴母细胞。他们使用13种不同的有效载荷基因(包括一些可能具有治疗作用的基因)测试了递送系统，并能够将它们插入基因组的九个不同位置。
在这些细胞中，研究人员能够以5-60%的成功率插入基因。这种方法还在基因整合位点产生了极少不需要的“插入缺失”。
更具体地说，作者指出，PASTE的编辑效率“类似于或超过同源定向修复和基于非同源末端连接的方法，在非分裂细胞和体内具有较少可检测到的脱靶事件。”
“我们看到的插入缺失很少，而且因为我们没有制造双链断裂，所以你不必担心染色体重排或大规模染色体臂缺失，”Abudayyeh说。
研究人员还证明，他们可以将基因插入小鼠的“人源化”肝脏中。这些小鼠的肝脏由大约70%的人类肝细胞组成，PASTE成功地将新基因整合到大约2.5%的这些细胞中。
研究人员在这项研究中插入的DNA序列长达36,000个碱基对，但他们相信还可以使用更长的序列。一个人类基因的范围可以从几百到超过两百万个碱基对，尽管出于治疗目的只需要使用蛋白质的编码序列，从而大大减少需要插入基因组的DNA片段的大小。
研究人员现在正在进一步探索使用该工具作为替代有缺陷的囊性纤维化基因的可能方法的可能性。该技术还可用于治疗由缺陷基因引起的血液疾病，例如血友病和G6PD缺陷，或亨廷顿氏病，这是一种由具有过多基因重复的缺陷基因引起的神经系统疾病。
“设计这些分子技术的一个奇妙之处在于，人们可以以我们可能没有想到或没有考虑过的方式构建、开发和应用它们，”Gootenberg说。“成为这个新兴社区的一员真的很棒。”